Seminario Lunes 19.09 14 hs
TITULO
Nuevo algoritmo para la caracterización de nuevas variantes en el gen de la tiroglobulina: integración de herramientas in silico y ensayos de expresión.
DISERTANTE
Lic. Mauricio Gomes Pio
Becario Doctoral CONICET
Director: Dr. Héctor M. Targovnik
INIGEM-UBA-CONICET
RESUMEN
La tiroglobulina (TG) es una glicoproteína homodimérica sintetizada por la glándula tiroides. Hasta la fecha, se han identificado doscientas veintisiete variaciones del gen TG en humanos. La dishormonogénesis tiroidea debida a mutaciones del gen TG tiene una incidencia estimada de aproximadamente 1 de cada 100 000 recién nacidos. El espectro clínico varía desde eutiroidismo hasta hipotiroidismo leve o severo. Las variantes sin sentido representan una gran cantidad de variaciones espontáneas que causan enfermedades humanas. Dichas variantes pueden comportarse con patrones heterogéneos de patogenicidad, dependiendo de los aminoácidos y estructuras involucradas y el impacto de la variante para crear reordenamientos de plegamiento. Por lo tanto, la patogenicidad de las mutaciones sin sentido puede ser más difícil de predecir.
En el presente trabajo mostramos predicciones de patogenicidad de dos variantes novedosas en TG identificadas por nuestro grupo, p.Pro2232Leu y p.Cys1282Tyr, donde combinamos el resultado entre programas de predicción de patogenicidad, modelado de proteínas usando ChimeraX y el gold standard sistema de expresión de proteínas con el objetivo de perfeccionar nuestro conocimiento en la interpretación de resultados utilizando herramientas In Silico.
Los resultados muestran que de 20 programas, las variantes Pro2232Leu y p.Cys1282Tyr fueron definidas como patogénicas por 17 y 15 programas respectivamente. El análisis de QuimeraX mostró cambios estructurales importantes como la ruptura de los puentes de hidrógeno y el surgimiento de Clashes que podrían afectar el correcto plegamiento de ambas variantes. Para corroborar los resultados identificados In Silico se procedió a realizar mutagénesis dirigida sobre plásmidos recombinantes (pcDNA6-TG) y transfección de los mismos en células HEK93T. El Western Blot para comparar el lisado celular y el sobrenadante mostró que las variantes p.Pro2232Leu y p.Cys1282Tyr producían retención intracelular, corroborando las alteraciones encontradas en el análisis In Silico.
Nuestros resultados muestran que la combinación de programas de predicción In Silico con análisis de modelado de proteínas mejora y hace más efectiva la identificación y caracterización de variantes patogénicas.
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