Servicio de Microscopía
El Servicio de Microscopía se encuentra adherido al Sistema Nacional de Microscopia, Resol. 2017-10 APN.SECACT #MCT
Responsable:
Dr. Osvaldo Rey
Operadores:
Dra. Verónica Coccoz
Dra. Guadalupe Inés Álvarez
Microscopía de Fluorescencia, Fotoactivación y Adquisición de Imágenes de Células Vivas en Tiempo Real (ST 2834)
Prestación 1: Observación y análisis de muestras biológicas con marcadores fluorescentes.
Prestación 2: Observación y análisis de moléculas fusionadas con proteínas fluorescentes (fotoactivables o no) en tiempo real.
SERVICIO DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA, FOTOACTIVACIÓN Y REAL TIME IMAGING.
Presentación
El STAN (Servicio Tecnológico de Alto Nivel) de microscopía de fluorescencia del INIGEM se encuentra en el recinto del Laboratorio de vías de Señalización y Cáncer del INIGEM, en el cuarto piso del Hospital de Clínicas “José de San Martín”. Nuestra finalidad es facilitar la infraestructura y apoyo técnico necesarios para que se lleven a cabo trabajos de investigación del INIGEM y otros centros públicos o privados que requieran el uso de diversas técnicas de microscopía de fluorescencia. En especial a aquellos que involucren el uso de proteínas fluorescentes y el seguimiento de procesos celulares en tiempo real.
Por cualquier duda o consulta sobre nuestros servicios, no dude en comunicarse al (011) 5950-8811 o a microscopioinigem@gmail.com
Detalle del servicio
Brindamos un servicio de microscopía de epifluorescencia (no confocal) con accesorios adicionales para fotoactivación y adquisición de imágenes de células vivas en tiempo real. Todos nuestros objetivos son aptos para la observación de muestras por la técnica de Contraste por Interferencia Diferencial (DIC). También contamos con filtros para DAPI, CFP, GFP (FITC, Alexa 488), YFP y TRITC (DsRed, Alexa 546/568/594). Las imágenes pueden adquirirse en simultáneo con DIC y marcaciones en diferentes colores. La unidad láser para fotoactivación permite la activación de un pequeño pool de proteínas fusionadas a PA-GFP (u otra proteína fotoactivable/fotoconvertible a 405nm) y el seguimiento de su dinámica intracelular en el tiempo.
El manejo del equipo se encuentra a cargo de personal especializado, que le brindará asesoramiento técnico en cuanto al diseño experimental, la adquisición de imágenes y el análisis de los resultados en caso de ser necesario.
Los tiempos de ejecución de las prestaciones puede variar significativamente de acuerdo a su diseño experimental. Por lo tanto, recomendamos comunicarse con nuestro asesor técnico para tener una idea aproximada de la cantidad de horas a contratar.
Turnos
La reserva de turnos se realiza mediante el sistema de gestión de turnos del Sistema Nacional de Microscopía:
https://www.argentina.gob.ar/ciencia/sact/sistema-de-gestion-de-turnos
Para ello, deberá registrarse en sistema, luego entrar con su usuario y buscar INIGEM en la lista de instituciones adheridas. Deberá proveer algunos datos sobre el tipo de muestra, y cuando el sistema pregunte si necesita asistencia deberá indicar que sí. La presencia del técnico a cargo durante el uso del equipo es obligatoria, independientemente de la experiencia previa del usuario.
Por cualquier consulta, comunicarse directamente con el responsable técnico al 5950-8811, o microscopioinigem@gmail.com.
Equipamiento
Contamos con un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E PFS, acoplado a una lámpara de mercurio, una unidad láser 405nm para fotoactivación y accesorios para Live cell imaging.
El sistema de iluminación para fluorescencia consiste en una lámpara de mercurio X-Cite® Exacte (Excelitas Technologies®) con el sistema Closed-Loop Feedback™, que permite mantener una intensidad ajustable y constante a lo largo del experimento.
El sistema de iluminación láser para fotoactivación está compuesto por un láser diodo OBIS (Coherent®) de 405nm.
Los accesorios para la adquisición de imágenes en tiempo real forman parte del sistema Live Cell Microscopy Delta T™ Culture Dish System (Bioptechs™). Éste incluye todo el equipamiento necesario para mantener una temperatura estable y la perfusión de medio fresco y CO2 a las células durante experimentos de larga duración. También permite realizar técnicas que requieran ciclos de enfriamiento y calentamiento.
Vea las especificaciones en:
http://www.bioptechs.com/wordpress/product/delta-t-starter-set/
La cámara digital es monocromática, de marca ANDOR modelo Neo 5.5 sCMOS. Posee un rango dinámico máximo de 30.000:1 (16 bits) y espectro ampliado hacia el infrarrojo (Near Infrared). Opera en dos modos opcionales: Global shutter y Rolling shutter. Permite la observación de procesos rápidos, con una velocidad máxima de adquisición de 30 fps (cuadros por segundo) con el tamaño total del campo (2560 x 2160 px), o hasta 100 cuadros por segundo en un área de interés (ROI) de 512 x 512 px.
El equipo está montado sobre una mesa neumática anti-vibraciones (TMC vibration control, AMETEK), para evitar posibles movimientos que alteren la adquisición de imágenes durante experimentos in vivo.
Objetivos disponibles
• Plan Apo λ 20X con cobertura de nano cristales, AN 0.75, ∞/0.17, WD 1.0, DICN2.
• S Plan Fluor ELWD 20X, AN 0.45, ∞/0-2 (con collar de corrección), WD 8.2-6.9, DICN1.
• S Plan Fluor ELWD 40X, AN 0.60, ∞/0-2 (con collar de corrección), WD 3.6-2.8, DICN1.
• Plan Apo VC 60X, AN 1.20, ∞/0.15-0.18 (con collar de corrección), WD 0.31-0.28, DICN2, de inmersión en agua.
• Plan Apo VC 100X, AN 1.40, ∞/0.17, WD 0.13, DICN2, de inmersión en aceite.
Las especificaciones detalladas de los mismos están disponibles en:
https://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Productos/Optica-y-Objetivos/Objetivos-apocromaticos/CFI-Plan-Apo-Lambda
https://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Productos/Optica-y-Objetivos/Objetivos-de-fluorita/Serie-fluorita-Plan-CFI
https://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Productos/Optica-y-Objetivos/Objetivos-apocromaticos/Serie-apocromatica-Plan-CFI-corregidos-en-violeta
Cubos para epi-fluorescencia:
• UV-2E/C: Filtro excitador ultravioleta (360/40nm), filtro de emisión (460/50nm) y espejo dicroico (400nm). Apto para DAPI, Hoechst.
• B-2E/C: Filtro excitador azul (480/30nm), filtro de emisión (535/40nm) y espejo dicroico (505nm). Apto para EGFP, FITC, Naranja de acridina, Alexa 488, etc.
• G-2E/C: Filtro excitador verde (540/25nm), filtro de emisión (630/60nm) y espejo dicroico (565nm). Apto para Rodamina, TRITC, Ioduro de Propidio, DsRed.
• Cyan GFP: Filtro excitador (436/20nm), filtro de emisión (480/40nm) y espejo dicroico (455nm). Apto para Cyan Fluorescent Protein (ECFP).
• Yellow GFP BP HYQ: Filtro excitador (500/20nm), filtro de emisión (535/30nm) y espejo dicroico (515nm). Apto para Yellow Fluorescent Protein (EYFP).
Metodología
El usuario debe asistir con las muestras previamente fijadas, marcadas o tratadas de acuerdo a la prestación contratada. No preparamos muestras. Estas muestras pueden estar preparadas sobre portaobjetos con cubreobjetos convencionales, o en placas de cultivo aptas para microscopía como por ejemplo CELLview™ cell culture dish (GBO).
Para ensayos con células vivas en tiempo real, las células deben ser cultivadas en placas especiales con fondo de vidrio y compatibles con el sistema térmico de tipo Delta T culture dish 0,17mm glass (BIOPTECHS, Cat N° 04200417B). De no contar con dichas placas, nuestro equipo puede proveerlas por un costo adicional al servicio. El usuario deberá retirarlas y abonarlas previamente al día del turno. La solución fisiológica o medio sin colorante (ej: DMEM sin rojo fenol) para perfundir durante el experimento deben ser proveídos por el usuario.
Las imágenes, tablas de datos, etc. se grabarán en DVDs proveídos por el usuario. Tenga en cuenta que el peso aproximado de una imagen (cuadro) en formato original .nd2 es de aproximadamente 10,74 Mb. Por ejemplo: si Ud. desea realizar una adquisición de 10 cuadros por segundo, durante 10 segundos, en total serán 100 cuadros = 1.074 Mb; y esto multiplicado por el número de muestras. Las imágenes pueden también exportarse en formato tif, avi, mp4, etc.